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产品简介

空间转录组学(Spatial Transcriptomics)是指在组织切片上完成,保留样本空间信息的组学研究。空间转录组可展示组织切片中不同区域的基因表达情况,揭示精细病理区域中激活的信号通路,完成分子特征驱动病理特征的机制解析。空间转录组学完成了病理数字化结合病理影像化的技术革新,对于诊断标志物、耐药位点以及靶向药物的研发,免疫治疗等新兴领域都具有重要作用。

我们的优势

1、 拥有先进的冷冻切片机LEICA CM1950。搭配切片经验丰富的实验团队,对多种组织类型的切片厚度与切片温度进行测试优化获得示组织内真实表达水平的高质量冷冻切片提供硬件和技术保障。

2、 拥有行业先进的3DHISTECH公司的PANNORAMIC系列的数字切片扫描仪,可以同时实现明场与荧光场下冷冻切片的快速扫描成像;Z-Stack多层聚焦扫描及Extended Focus 景深扩展多层融合扫描模式,进一步提升分辨率和清晰度,保证切片高分辨的数字图像信息精准采集;

3、 具备丰富的空间转录组测序和数据分析经验,具有完善的空间转录组联合单细胞转录组数据分析方案,能够实现个性化、定制化地数据分析服务。

4、 烈冰提供空间转录组全流程服务,包括样本包埋、切片、选片、HE染色、组织透化、建库测序、以及后续的FISH验证等各个步骤,为您提供无忧服务。

样本要求

样本类型:
1.冰冻组织: 新鲜样本经液氮预冷的异戊烷速冻,-80℃保存;
2.OCT包埋组织: 新鲜组织异戊烷速冻后进行OCT包埋,或新鲜组织直接OCT包埋后-80℃速冻 注意标明样本方向,样本于-80℃保存。

注意事项:

1.样本处理和运输过程需要再低温环境。
2.如果样本充足,最好准备2份及以上,一份用于RNA质控和后续的正式切片实验;一份留作备用;
3.如果组织样本珍贵稀缺,可以酌情减少样本数量。

实验流程


1. 冷冻切片的制备:注意提前将冷冻组织与玻片放入-20℃冷冻切片机箱体中平衡30分钟以上,再进行切片

2. HE染色、拍照成像:组织切片贴合在玻片上,通过甲醛固定、H&E染色并在明场下拍照得到组织切片的形态结构

3. 组织优化:采用组织酶解的方式进行透化,使细胞中的mRNA释放并结合到芯片相邻的捕获探针上,反转录合成cDNA后,移除组织,进行荧光场扫描成像,根据荧光强度判断最优的透化时间。

4. 透化和cDNA合成:采用组织酶解的方式,选取最佳的透化时间进行透化,芯片的捕获探针捕获到mRNA后,反转录合成cDNA

5. 文库构建:对cDNA进行随机引物PCR扩增

6. 上机测序:采用Illumina Hiseq或NovaSeq测序平台进行测序。

数据分析流程

结果示例

1、冷冻切片的制备
根据组织类型设定好切片温度与厚度,将质检合格的冷冻组织和10x玻片先放-20℃冷冻切片机箱体中平衡30分钟以上,再进行切片

2、明场扫描成像
采用PANNORAMIC系列的数字切片扫描仪,实现明场下冷冻切片的快速扫描成像,以观察所选组织切片的形态结构

3、透化
以贴合在带有mRNA结合捕获探针的载玻片上的组织切片为对象,根据预透化确定的最佳透化时间,采用组织透化酶进行透化,释放细胞中的mRNA。

4、文库构建、上机测序
以捕获的mRNA反转录产物PCR扩增开始进行文库构建,获得每个样本的测序文库。接着采用Illumina Hiseq或NovaSeq高通量测序仪对文库进行测序,获得每个样本的测序数据。

5、原始数据质量控制
以原始数据为研究对象,采用Fastp软件对于低质量序列,未检测序列,接头序列进行过滤,并对于过滤前后数据的GC比值,碱基质量,长度分布,接头留存,Duplication比率等指数进行分析,将过滤后数据命名为Clean Data。

6、点阵判断
以测序数据为研究对象,采用barcode处理算法,对测序数据中的cell barcode信息及其对应的counts数进行统计,判断测序样本中实际检测到的点阵数,获得真实的空间转录组测序信息。

7、基因组比对
以cell barcode对应的reads为研究对象,采用RNA比对算法,将测序数据比对到物种对应的基因组上,获得基因组比对的bam文件,并基于bam文件进行信息统计,得到基因组比对率等信息。

8、空间转录组测序数据标化
以基因组比对后的bam文件以及基因组注释文件为研究对象,将比对到同一基因上的UMI进行合并,并去除其中重复的UMI序列,得到每个基因的UMI数量,统计每个空间点阵中检测到的基因数以及转录本数量,并得到表达量矩阵表,同时进行染色。

9、空间点阵聚类与亚群分析
以基因组比对结果以及表达量结果为研究对象,对测序检测到的细胞进行过滤,并根据表达矩阵进行细胞的降维和聚类,将空间点阵分为不同的Cluster聚类簇,采用UMAP算法和tSNE算法展示,并在空间染色片上进行展示。

10、点阵Cluster聚类簇Marker分析
以点阵分群结果为研究对象,鉴定不同点阵亚群中的Marker基因,并对Marker基因的表达分布进行可视化展示。 Aldoc 星状胶纸;Gad1 抑制性神经元;Gad2 抑制性神经元;Mbp 少突胶质细胞;Slc17a6 兴奋性神经元;Slc17ca7 兴奋性神经元

11、解剖区域细分
以每个点阵中的表达量数据为研究对象,根据用户指定的解剖区域(临近切片或者当前切片)进行结果展示,包括基因区域的集中展示。

12、信号通路Scoring分析
以每一个点阵的基因表达为研究目标,采用ssGSEA算法,对于每一个点阵的信号通路代谢通路的富集程度进行打分,绘制调控强度的打分结果图展示。

13、基因集染色分析
以点阵群体的表达为研究目标,采用预设基因集,对于点阵群体的基因集表达的程度进行分析和着色

14、差异基因筛选
以点阵分群结果为研究对象,针对特定点阵亚群,进行点阵亚群间差异表达基因筛选,获得细胞亚群间差异表达基因,并绘制火山图和热图。

15、功能分析(GO Analysis)& 信号通路分析(Pathway Analysis)
以Marker基因/差异基因为研究对象,采用NCBI/UNIPROT/SWISSPROT/ AMIGO等GO数据库,对于基因群体进行功能分析得到该基因群体所显著性富集的功能条目,命名为GO Analysis。以Marker基因/差异基因为研究对象,采用KEGG数据库,对于基因群体进行信号通路分析,得到该基因群体所显著性富集的信号通路条目,命名为Pathway Analysis。

16、点阵群体基因富集分析
以点阵群体的表达,采用Qusage算法对于每一个点阵群体的基因的富集性的基因集合进行描述,得到每一个群体的基因集合的富集差异。

17、细胞通讯分析
采用Cellphone算法,针对不同点阵亚群cluster之间或内部的Ligand-Receptor关系进行分析,展示了微环境中跨细胞类型的通讯关系,帮助解析微环境的形成机制和调控机理。

高级数据分析

文献示例

1. Willis EF, MacDonald KPA, Nguyen QH, et al. Repopulating Microglia Promote Brain Repair in an IL-6-Dependent Manner. Cell. 2020;180(5):833‐846.e16.(IF=36.216)

2. Baccin C , Al-Sabah J , Velten L , et al. Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization[J]. Nature Cell Biology, 2020, 22(1):1-11.(IF=17.428

3. Moncada R, Barkley D, Wagner F, et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nat Biotechnol. 2020;38(3):333‐342.IF=31.864

4. Asp M, Giacomello S, Larsson L, et al. A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart. Cell. 2019;179(7):1647‐1660.e19. (IF=36,216)

5. Maniatis S, Äijö T, Vickovic S, et al. Spatiotemporal dynamics of molecular pathology in amyotrophic lateral sclerosis. Science. 2019;364(6435):89‐93. (IF=41.037)

6. Thrane K, Eriksson H, Maaskola J, Hansson J, Lundeberg J. Spatially Resolved Transcriptomics Enables Dissection of Genetic Heterogeneity in Stage III Cutaneous Malignant Melanoma. Cancer Res. 2018;78(20):5970‐5979. (IF=8.378)

7. Berglund E, Maaskola J, Schultz N, et al. Spatial maps of prostate cancer transcriptomes reveal an unexplored landscape of heterogeneity. Nat Commun. 2018;9(1):2419.(IF=11.878)

8. Giacomello S, Salmén F, Terebieniec BK, et al. Spatially resolved transcriptome profiling in model plant species. Nat Plants. 2017;3:17061. Published 2017 May 8. (IF=13.297)

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